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當細胞生物學家第一次發現可能有一種脂質參與他們最喜歡的途徑時，這有點像在馬路對面找到一堵墻(就像當脂質學家在他們的路上找到一種蛋白質一樣……)。
由于脂質的不同性質，大多數細胞生物學家都害怕在他們的研究過程中不得不面對這種情況。好消息是，有一些簡單的方法可以幫助克服這一障礙，使研究特定途徑中的脂質變得更容易。在這里，我想介紹一些脂配體相互作用研究的分析和準備工具。
1 覆蓋試驗Overlay assays-鑒定與給定蛋白質相互作用的脂質
這些分析方法允許鑒定一種或多種脂質與給定蛋白質相互作用。
與Western-blot原理類似，它們的原理是在表面涂上各種類型的脂質，這些脂質將與已知的蛋白質接觸，這種蛋白質將被標記或抗體臨時檢測到。脂質的載體通常是硝化纖維素膜(圖1)。與點印跡法一樣，需要優化一些實驗參數(如緩沖液、蛋白質純化或蛋白質濃度)。
當可用蛋白質的數量有，小的“覆蓋分析格式"可以用少于0.5 mg的蛋白質進行檢測。這是一種簡單的方法來測試一種感興趣的蛋白質對各種脂質的結合能力!
為了檢查蛋白質對各種類型的脂質的相對親和力，硝基纖維素陣列被標記為每種脂質的梯度。幾個相同的陣列可以證明在測試單特異性或多特異性蛋白質有用。該技術顯示出高特異性(圖2)，結果甚至比ELISA試劑盒更干凈，再次強調了實驗條件優化的必要性。
對于那些對膜不熟悉的人，或者正在研究大量蛋白質的人，也可以使用聚苯乙烯板，用各種類型的脂質共價涂覆(稱為COVA板)。用于高含量篩選的微陣列板格式允許您在單個板上測試具有不同脂質的幾種蛋白質(親和性)。平板的每孔都有9種不同的脂質，用于檢測先前標記或通過免疫檢測的蛋白質。圖3所示的是一個蛋白質結構域(已知與兩種不同的脂質相互作用)。對于前面介紹的設置，需要優化蛋白質濃度。
2 下拉試驗Pull-down assays-發現一種已知脂質的蛋白質伙伴
對于相反的實驗設置，當您想要識別已知脂質的蛋白質伴侶時，瓊脂糖為基礎的下拉試驗等制備技術將是您的選擇:
*瓊脂糖珠包被確定的脂質可以被進一步孵育與細胞裂解液，上清液，重組蛋白…
* 然后相互作用的復合體通過離心將它們拉下來。
它允許分離脂質結合蛋白的數量適合進一步鑒定和表征。它經常與細胞裂解液一起用于“撈出"脂質對偶物(圖4)。
3 漂浮試驗Floatation assays-用于更高特異性的蛋白質-脂質相互作用
當你在尋找更高特異性的蛋白質-脂質相互作用時，另一種基于脂質富集脂質體(用作脂質/配體相互作用的基質支持)的制備方法是可用的。
與GEM脂筏提取(葡萄糖梯度超離心)類似，脂質體預結合到脂質配體上，將沿著超離心制備的葡萄糖梯度分成幾個部分分布(圖5)。
這些富脂脂質體有許多優點:
*聚脂質體PolyPIPosomes是聚合的脂質體，
*增加穩定性(長達6個月)，
*生物素標簽，方便鏈霉親和素檢測，
*尺寸均勻(~200 nm)，可進行浮選試驗，
*這些脂質體也可用于:表面等離子體共振，脂質體覆蓋分析，ITC。
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